Результаты исследования

Как и в классических лабораторных исследованиях, в данном труде был

использован метод регенерации молочной железы для оценки пластичности

DESC клеток, а также их умения генерировать эпителиальные клетки

молочной железы после трансплантации в жировые отложения (1А).

DESC, экспрессирующие маркеры как эпителиальных, так и стволовых клеток (1B), были получены из цервикальной петли* резцовых зубов с помощью зеленого флуоресцентного белка (GFP) для идентификации.

Цервикальная петля* — область на эмалевом органе в развивающемся зубе, где соединяются наружный и внутренний эмалевые эпителии.

Полученные DESC были смешаны с первичными эпителиальными клетками

молочной железы (MECs) и введены в безэпителиальные жировые прокладки

молочной железы мышей, иммунокомпрометированных геном RAG1 (ген,

активирующий рекомбинацию).

Линии клеток, полученные из этих двух клеточных популяций, определялись

по экспрессии GFP для DESC и индуцированной лентивирусом экспрессии

флуоресцентного белка DsRed для MEC.

В качестве контрольной группы использовались мыши, которые получали инъекции только MEC клеток.

Через 8 недель после трансплантации (1C–1I) и на 16.5 день беременности

(1J и 1K) в молочных железах DESC и MEC клетки образовали химерные

протоковые структуры, состоящие из GFP-положительных клеток,

происходящих из DESC, и DsRed-положительных клеток MEC.

Далее ученые решили провести более детальный анализ распределения

трансплантированных DESC в развивающихся химерных протоках. Для этого

было проведено двойное иммунофлуоресцентное окрашивание для GFP и

кератина 14 (Krt14), которые являются маркерами базальных /

миоэпителиальных клеток в молочной железе взрослого человека.

GFP-положительные клетки наблюдались как в Krt14-положительных миоэпителиальных*, так и в Krt14-отрицательных люминальных* компартментах* (2C-2K).

Миоэпителиальные клетки* — экспрессируют белки, характерные для

эктодермального эпителия и для гладкомышечных клеток. Данный тип клеток

окружает секреторные отделы и выводные протоки молочных, слюнных,

слезных и потовых желез.

Люминальные клетки* — выстилают апикальную (верхушечную) поверхность

нормального молочного протока и обладают секреторными свойствами.

Большинство разновидностей рака молочной железы возникают именно из люминальных клеток.

Компартмент* — пространство внутри клетки, окруженное мембраной и связанное с исполнением определенной клеточной функции.

Из всех эпителиальных компартментов химерных протоков молочной железы около 20% клеток происходили от DESC.

Люминальный эпителий молочной железы, как напоминают нам ученые,

является весьма сложной структурой из различных клеточных популяций,

которые можно классифицировать на две группы: протоковые и альвеолярные.

Протоковые клетки выстилают эпителиальные протоки. Среди этих

клеток есть те, что экспрессируют альфа рецепторы эстрогена. Они

отвечают за активацию паракринной передачи сигналов (касательно

соединения клеток в конкретном органе), необходимой для удлинения

эпителия молочной железы при воздействии пубертатных эстрогенов.

Альвеолярные клетки, в свою очередь, являются основой секретирующих молоко альвеолярных отростков, которые возникают во время поздней беременности.

Двойная иммунофлуоресценция для GFP (зеленый флуоресцентный белок) и ER

(рецептор эстрогена) в химерном эпителии показала, что GFP-положительные

клетки могут давать как ER-положительные, так и ER-отрицательные

люминальные клетки (2L-2N).

Способность GFP-положительных клеток индуцировать образование

люминальных клеток была дополнительно подтверждена с помощью двойного

иммунофлуоресцентного окрашивания для GFP и кератина 8.

Одним из самых важных наблюдений во время иммунофлуоресцентного и

иммуногистохимического анализа было то, что GFP-положительные DESC

клетки могут преобразовываться в полностью функциональный фенотип

β-казеин* положительные альвеолярные клетки, продуцирующие молоко

(2О-2R).

Казеин* — один из основных белков в составе молока (40% в женском молоке).

На следующем этапе исследования ученые решили проверить насколько DESC

клетки пластичны и способны ли они перепрограммировать регенерацию

протоков при отсутствии эпителия молочной железы.

Для этого был проведен лабораторный анализ методом клеточной

трансплантации, но без применения эпителиальных клеток молочной железы,

когда DESC вводились напрямую в жировую подкладку (3А).

анализ всей структуры (без диссекции) выявил образование

GFP-экспрессирующих небольших разветвленных эпителиальных структур (3В).

Иммунофлуоресценция для GFP и детальный гистологический анализ показали,

что эти образования возникли исключительно за счет клеток, происходящих

из DESC (3Е), и то, что они окружены плотной фиброзной (соединительной)

тканью (3C и 3D).

Морфология клеток, составляющих рудиментарные протоки, была достаточно

разнообразной: от сплюснутой до столбчатой формы (3D). Для более

подробного анализа этих образований была проведена оценка распределения

Krt14 и ER.

Иммунофлуоресцентный анализ показал, что эти структуры состоят как из

Krt8-экспрессирующих люминальных клеток, так и из Krt14-положительных

миоэпителиальных клеток (3F и 3G).

ER-экспрессирующие клетки были также обнаружены в эпителии этих

протоков, но их экспрессия была значительно ниже, чем в полностью

развитых химерных эпителиальных образований молочных желез (3H).

Также была обнаружена экспрессия казеина в некоторых протоках, происходящих из внедренных DESC (3I).

Это говорит о том, что полученные клетки вполне способны инициировать

дифференцировку в направлении вырабатывающих молоко альвеолярных клеток.

Еще более любопытным наблюдением стало наличие экспрессии амелогенина,

являющегося типичным маркером дифференцировки амелобластов (3J). Дело в

том, что эти клетки относятся к продуцентам органических составляющих

зубной эмали.

Следовательно, можно предположить, что имеет место как минимум частичная

клеточная память о ее происхождении, несмотря на смену спецификации

клеток.

К сожалению, некоторые из созданных структур преобразовывались в

кистозные образования (3K-3M), для которых характерны уплощенные

эпителиальные клетки, образующие монослой (3L и 3M). На данном этапе

исследования такие кистозные образования возникали в 80% случаев, однако

данный показатель будет уменьшаться в ходе совершенствования методики.

Во время проведения трансплантации DESC клеток достаточно часто наблюдалось образование плотной фиброзной ткани.

Фиброз был обнаружен в некоторых жировых прокладках молочной железы, где

внедрялись MEC и DESC, а также во всех жировых подкладках при внедрении

только DESC (4A и 4B).

Неэпителиальная ткань, окружающая протоки, была составлена из очень

плотной сети коллагеновых волокон, как показало трихромное окрашиванием

Массона* (4C и 4D).